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Modelle und Methoden

 

Verwendete Modelle und Methoden

 

1. Isolierte Epithelien als Modelle für gastrointestinale Transportprozesse

2. Vorübergehend isolierter und gewaschener Pansen als in vivo Modell

3. Primärkultivierte Epithelzellen zur Untersuchung epithelialer Regulationsmechnismen auf zellulärer Ebene

4. Isolierte Nerv-Muskulatur Präparationen aus dem Darm

5. Nachweis und Quantifizierung von Proteinen (und weiteren Substanzen) auf zellulärer und molekularer             Ebene

 

 

1. Isolierte Epithelien als Modelle für gastrointestinale Transportprozesse

 

Wir isolieren aus frisch geschlachteten Schafen und Schweinen Stücke gastrointestinalen Epithels. Die Verwendung solcher Epithelpräparationen ex vivo hat den Vorteil, dass Untersuchungen gezielt auf epitheliale Prozesse ausgerichtet werden können, aber dabei der natürliche Zellverband erhalten bleibt.  Dies ist vor allem für Untersuchen mit Hilfe der  Ussing-Kammer-Technik von entscheidendem Vorteil. Durch Verwendung der Ussing-Kammer-Technik können bei den Epithelpräparationen einerseits die elektrophysiologischen Charakteristika (Strom, transepitheliale Potentialdifferenz, Leitfähigkeit) erfasst werden. Diese geben zum einen Hinweise auf elektrogene Tranportprozesse - also solche die mit einer Verschiebung von elektrischen Ladungen einhergehen - über das Epithel hinweg. Zum anderen kann die Dichte des Epithels eingeschätzt sowie Veränderungen der epithelialen Leitfähigkeit erfasst werden.  Weiterhin ist es möglich über die Zugabe radioaktiver Isotope in die Ussing-Kammer den Transport von Substraten über das Epithel qualitativ und quantitativ zu erfassen. Von uns wird die Untersuchung isolierter Epithelien in der Ussingkammer zur zeit zur Charakterisisierung des Fettsäuretransports über das Pansenepithel, sowie zur Untersuchung der durch neurotranmittel modulierten Sekretionsvorgänge im porcinen Colon genutzt.

 

2. Vorübergehend isolierter und gewaschener Pansen als in vivo Modell

 

Erkenntnisse aus Untersuchungen an isolierten Epithelien des Vormagens können von uns in vivo überprüft werden. Dazu stehen uns mehrere Schafe mit einer permanenten Pansenfistel zur Verfügung. Über die Fistel kann der vorhandene Panseninhalt entleert und ein künstlicher Panseninhalt mit genau definierter Zusammensetzung in den Vormagen eingefüllt werden. Während der Versuche wird der Pansen derart isoliert, dass ein Entweichen des Inhalts in den Labmagen nicht möglich ist. Somit kann durch die Messung von Konzentrationsänderung einzelner Inhaltsstoffe des künstlichen Panseninhalts auf Resorptionsvorgänge aus dem Vormagen unter in vivo-Bedingungen rückgeschlossen werden.

 

3. Primärkultivierte Epithelzellen zur Untersuchung epithelialer Regulationsmechnismen auf zellulärer Ebene

 

Untersuchungen an kultivierten Epithelzellen habe den Vorteil, dass epitheliale Regulationsmechnismen frei von systemischen Einflüssen untersucht werden können, definierte Zellpopulationen für die Unbtersuchungen verwendet werden und auch längerfristige Manipulationen an den Zellen möglich sind. Im Institut stehen vonuns etablierte Primärkulturen oviner Pansenepithelzellen und porciner Colonepithelzellen zur Verfügung. An den ovinen Zellen kann die Expression verschiedener Transportproteine sowie Regulationsmechnismen zur Konstanthaltung des intrazellulären pH-Wertes im Pansenepithel erfasst werden . 
Die porcinen Epithlezellen können auf porösen Filtern kultiviert werden und bilden so ein artifizielles Colonepithel mit definierter apikaler und basolateraler Seite Durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands ist es möglich die Integrität des „Epithels“ sowie Veränderungen derselben durch körpereigenen und körperfremde Stoffe zu dokumentieren.

 

4. Isolierte Nerv-Muskulatur Präparationen aus dem Darm

 

Ebenso wie die beschriebenen isolierten Epithelpräparationen haben auch Präparate aus gastrointestinaler Muskulatur mit anhaftendem myenterischen Plexus den Vorteil, dass sie ex vivo untersucht werden können, die Integrität des ursprünglichen gewebeverbands aber weitgehend erhalten bleibt. Wir benutzen solche Präparationen zum einen zur funktionellen Untersuchung nervaler Schaltkreise, die die Colonmuskulatur steuern . Weiterhin ist es möglich und im Institut etabliert, besagte Nerv-Muskel Präparationen für mehrere Tage zu kultivieren um beispielsweise mit Hilfe retrograder Farbstoffe, die Innervationsmuster der vorhandenen Nervenzellen direkt zu identifizieren.

 
5. Nachweis und Quantifizierung von Proteinen (und weiteren Substanzen) auf zellulärer und molekularer             Ebene
 

Neben oben beschriebenen Modellen sind im Institut ebenso verschiedene molekular- und zellbiologische Techniken etabliert, die Protein nachweise und Quantifizierungen direkt oder indirekt über mRNA Nachweise erlauben. Zu den angewandten Techniken gehört z.B. der Western blot und verschiedene PCR Verfahren. Weiterhin werden verschiedene epitheliale Proteine (Transportproteine sowie Cytoskelett- und tight junction- Bestandteile) und Neurotransmitter des enterischen Nervensystems  immunhistochemisch mittels indirekter immunfluoreszenz Färbung nachgewiesen. Neben dem reinen Nachweis und der Lokalisation der Proteinstrukturen kann Software- unterstützt auch eine Quantifizierung vorgenommen werden.
Um andere (nicht Protein) Substrate in niedrigen Konzentrationen nachweisen zu können steht im Institut eine HPLC Einheit zur Verfügung. Damit können beispielsweise Flavonole in Blutproben in niedrigen nanomolaren Konzentrationen quantifiziert werden.